山茱萸產(chǎn)新行情堅(jiān)挺 各產(chǎn)地含量差異評(píng)測

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　 山茱萸( Fructus Corni)為山茱萸科落葉小喬木(Cornus officinalis Sieb. et Zucc.)的干燥成熟果肉，是一種常用的補(bǔ)益中藥，味酸澀，性微溫，有溫補(bǔ)肝腎、固澀精氣之功，主治腰膝疼痛、眩暈、耳鳴、陽痰遺精、小便頻數(shù)、月經(jīng)過多、漏下不止等癥。陜西佛坪、河南西峽、浙江淳安是其三大主產(chǎn)區(qū)。

　　山茱萸的主要成分包括環(huán)烯醚萜苷及苷元、有機(jī)酸及其酯類、鞣質(zhì)、多糖等。莫諾苷、馬錢苷和獐牙菜苷是山茱萸中最主要的環(huán)烯醚萜苷類成分，三者在藥材中的含量分別約為2%，0.6%，0.1%。

　　現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)它們具有廣泛的生物活性：莫諾苷具有對神經(jīng)的保護(hù)與修復(fù)作用，能夠促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化，抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡，提高腦血流量； 馬錢苷具有調(diào)節(jié)免疫、抗脂質(zhì)過氧化和抗休克以及治療糖尿病型腎病的作用； 獐牙菜苷具有退熱、抗驚厥，抗D-氨基半乳糖所致肝損傷的作用。因此，這3種環(huán)烯醚萜苷被認(rèn)為是山茱萸中的特征成分，可以作為山茱萸原藥材、飲片以及含有山茱萸成藥的質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分。

　　不同產(chǎn)地山茱萸環(huán)烯醚萜苷化合物含量評(píng)測

　　有關(guān)山茱萸成分的含量測定方法已有不少報(bào)道，而筆者認(rèn)為，這3個(gè)環(huán)烯醚萜苷化合物是山茱萸中較為突出的活性成分，對這三者進(jìn)行同時(shí)測定，是對山茱萸的質(zhì)量控制方法的完善，故本實(shí)驗(yàn)將建立一個(gè)同時(shí)測定考察不同產(chǎn)地、不同采收時(shí)間山茱萸山中莫諾苷、馬錢苷和獐牙菜苷的方法，為山茱萸的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù)，同時(shí)為山茱萸的良種選育提供測定方法。

　　用80%甲醇稀釋混合對照品溶液，進(jìn)樣測定，確定檢測限(S/N=3∶1)和定量限(S/N =10∶1)。見表1。

表1 峰面積與濃度的線性關(guān)系、檢測限和定量限

　　分別取不同產(chǎn)地和不同采收期山茱萸藥材各3份，按制備供試品溶液。在上述色譜條件下，分別進(jìn)樣10μL進(jìn)行測定，記錄各個(gè)峰面積，用外標(biāo)法計(jì)算山茱萸中3個(gè)環(huán)烯醚萜苷的含量，結(jié)果見表2、表3。由表2可見，平原地區(qū)所產(chǎn)的山茱萸中3 個(gè)環(huán)烯醚萜苷的總含量較山區(qū)所產(chǎn)含量高出1倍。其原因尚待進(jìn)一步研究。西北大學(xué)果園山茱萸中3個(gè)環(huán)烯醚萜苷的平均總含量為42.55mg·g ^{- 1}，表2 中所選為最高含量。由表3可見，山茱萸中的莫諾苷，馬錢苷與獐牙菜苷這3個(gè)環(huán)烯醚萜苷在10 月中旬時(shí)含量分別達(dá)到最高。

表2 不同產(chǎn)地山茱萸中3 個(gè)環(huán)烯醚萜苷成分含量

測定結(jié)果( mg·g － 1 ，n = 3，RSD ＜ 3%)

　　藥材烘干溫度和烘干時(shí)間的影響本實(shí)驗(yàn)考察了藥材烘干溫度對莫諾苷，馬錢苷與獐牙菜苷含量的影響。選取同一批樣品(陜西佛坪)分別在40，50，60，70，80，90 ℃的溫度下烘干至恒重，按方法制備供試品溶液。在上述色譜條件下，分別進(jìn)樣10μL進(jìn)行測定，記錄3個(gè)環(huán)烯醚萜苷的峰面積并進(jìn)行對比，結(jié)果得出40 ℃下烘干即可得到最大含量的莫諾苷、馬錢苷和獐牙菜苷，而隨著烘干溫度的上升含量依次下降。同時(shí)考察了不同烘干時(shí)間對這3個(gè)成分含量的影響。同一批樣品(陜西佛坪)在40℃下烘干至恒重，開始計(jì)時(shí)，分別在0.5，1，1.5，2，2.5，3h 時(shí)取樣按方法制備供試品溶液。在上述色譜條件下，分別進(jìn)樣10μL進(jìn)行測定，記錄3個(gè)環(huán)烯醚萜苷的峰面積并進(jìn)行對比，結(jié)果表明40 ℃下烘干恒重后再烘干3h 內(nèi)對3個(gè)成分基本無影響。

表3 不同采收期西北大學(xué)果園山茱萸中3 個(gè)環(huán)烯醚萜苷

成分含量測定結(jié)( mg·g － 1 ，n = 3，RSD ＜ 2%)

　　提取條件的優(yōu)化本實(shí)驗(yàn)考察了加熱回流法和超聲提取法對莫諾苷，馬錢苷與獐牙菜苷3個(gè)環(huán)烯醚萜苷提取量的影響。同一批樣品(陜西佛坪)加熱回流提取1 h 和超聲提取1h 提取效果差異不大，但超聲提取法操作方便，能提高效率，故選擇超聲提取法；同時(shí)也比較了70%，80%，100%甲醇溶液以及乙醇等試劑的提取效率，結(jié)果表明80%甲醇溶液提取率較高； 本實(shí)驗(yàn)對提取時(shí)間也進(jìn)行了優(yōu)化選擇，比較了超聲提取15，20，30，40，50，60min的提取效率，結(jié)果表明超聲30min時(shí)莫諾苷，馬錢苷與獐牙菜苷3個(gè)成分的提取量達(dá)到最大，之后的提取效率基本不變，故選擇提取時(shí)間為30min； 提取溶劑的用量選擇，比較了80%甲醇溶液用量10，20，25，30，40，50mL的提取效率，結(jié)果表明用量為25mL時(shí)既提取完全又節(jié)省溶劑，低碳環(huán)保，故優(yōu)化選擇80%甲醇溶液25mL(樣品0.1g) 超聲提取30min為本實(shí)驗(yàn)樣品的提取條件。

　　流動(dòng)相的選擇由于山茱萸中，莫諾苷、馬錢苷成分的測定前人已有研究，但采取的方法各不相同，于是本實(shí)驗(yàn)在選擇流動(dòng)相的配比時(shí)，試驗(yàn)了包括甲醇-水、甲醇-磷酸水溶液、甲醇-甲酸水溶液、甲醇-乙酸水溶液、乙腈-水、乙腈-磷酸水溶液、乙腈-甲酸水溶液、乙腈-乙酸水溶液組成的流動(dòng)相系統(tǒng)，比較分離效果和基線平穩(wěn)狀況，最終選擇了甲醇-磷酸水溶液系統(tǒng); 同時(shí)還對比了0.01%，0.05%，0.1%，0.2%濃度的磷酸對分離效果的影響，結(jié)果表明0.1%濃度的磷酸水溶液峰形和分離度較好，故確定甲醇-0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相。

　　檢測波長的選擇莫諾苷和馬錢苷的最大吸收波長在240nm處，獐牙菜苷的最大吸收在247nm處，但獐牙菜苷在240nm與247nm波長下的吸收差別很小，故本實(shí)驗(yàn)選擇240nm作為檢測波長。

　　不同產(chǎn)地的山茱萸中，莫諾苷以西北大學(xué)果園采收的含量最高，其次為陜西丹鳳，再次為陜西藍(lán)田； 馬錢苷以陜西丹鳳產(chǎn)含量最高，其次為西北大學(xué)果園，再次為陜西藍(lán)田；獐牙菜苷以西北大學(xué)果園采收含量最高，其次為陜西長安，再次為陜西藍(lán)田。產(chǎn)地的不同意味著很多影響因素的不同，如溫度、濕度，氣壓還有光照時(shí)間等等。以本實(shí)驗(yàn)為例，在3個(gè)成分的總體含量水平上以西北大學(xué)果園( 陜西西安)產(chǎn)為最佳，可能與該產(chǎn)地光照充裕，溫度較山區(qū)高且穩(wěn)定等生長環(huán)境有關(guān)。

　　在本次試驗(yàn)中，時(shí)間跨度為2010 年山茱萸開始結(jié)果的月份到開始落果的月份，不同采收時(shí)間的西北大學(xué)果園(陜西西安)山茱萸中莫諾苷的含量為15.21～50.50mg·g ^{- 1}，馬錢苷的含量為2.72～8.21mg·g^-1，獐牙菜苷的含量為0.30～1.43mg·g^-1。這3個(gè)環(huán)烯醚萜苷類成分經(jīng)考察均與果實(shí)的成熟程度稱正比例關(guān)系，也就是說，3個(gè)化合物隨果實(shí)的成熟含量呈遞增的趨勢。以本實(shí)驗(yàn)為例，在10月中旬達(dá)到一個(gè)含量最大值的平臺(tái)。故根據(jù)這3 個(gè)成分的含量變化趨勢表明: 山茱萸的最佳采收時(shí)間為每年10月中旬果實(shí)脫落之前。但也應(yīng)考慮到山區(qū)產(chǎn)地和平原產(chǎn)地在溫度、氣壓以及年降水量方面的差異而導(dǎo)致的最佳采收季節(jié)的變化。

　　本實(shí)驗(yàn)測定結(jié)果表明，莫諾苷，馬錢苷與獐牙菜苷作為山茱萸環(huán)烯醚萜苷類成分的指標(biāo)性化合物，它們的含量高低對于山茱萸藥材的質(zhì)量和藥用價(jià)值具有很重要的意義。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)產(chǎn)地和采收時(shí)間的變化，對于3 個(gè)成分的含量均有影響。而產(chǎn)地對其含量的影響比較大，說明產(chǎn)地是決定山茱萸次生代謝產(chǎn)物形成的主要因素。但以總體的角度來看，不論是在產(chǎn)地的不同還是在采收時(shí)間的變化上，這3個(gè)成分的含量變化趨勢是基本相同的。本實(shí)驗(yàn)方法不僅為山茱萸的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù)，還為山茱萸的良種優(yōu)育提供了研究依據(jù)。

  不同產(chǎn)地山茱萸揮發(fā)油成分評(píng)測

　　產(chǎn)地的揮發(fā)油結(jié)果的比較按步驟所得的3產(chǎn)地?fù)]發(fā)油結(jié)果見表4。

表4 3產(chǎn)地山茱萸果肉揮發(fā)油提取結(jié)果

　　揮發(fā)油成分分析報(bào)告及結(jié)果河南、山西、陜西3產(chǎn)地山茱萸果肉揮發(fā)油(其總離子流圖見圖1~ 圖3)分別被分離出66、57、56個(gè)峰, 通過計(jì)算機(jī)質(zhì)譜庫檢索并與標(biāo)準(zhǔn)圖譜對照, 分別被鑒定出53、46和35個(gè)化合物, 檢出率分別為80.30%、80.70%、84.32%，按面積歸一化法計(jì)算,各樣品已鑒定成分的面積之和占?xì)庀嗌V峰總面積的相對百分含量分別為95.36、94.06、85.50。檢測結(jié)果見表5。

　　本實(shí)驗(yàn)通過采用GC-MS聯(lián)用法分析了3個(gè)不同產(chǎn)地的山茱萸果肉揮發(fā)油的成分, 通過計(jì)算機(jī)質(zhì)譜庫檢索并與標(biāo)準(zhǔn)圖譜對照, 鑒定出的成分多為烷烴、烯烴、酸類、酯類及芳香族化合物. 3 產(chǎn)地山茱萸揮發(fā)油主要成分存在差異, 河南產(chǎn)山茱萸揮發(fā)油的主要成分是棕櫚酸(12.60)、9,12-十八碳二烯酸(10.28)、9,12,15-十八碳三烯酸(14.30)、順-9-十八碳烯酸酰胺、鄰苯二甲酸單2-乙基己酯、7-羥基卡達(dá)烯、9-十八碳烯酸、棕櫚酸酰胺、硬脂酸酰胺, 另外還有月桂酸、A-杜松醇、棕櫚酸甲酯等； 山西產(chǎn)山茱萸揮發(fā)油的成分有棕櫚酸(17.17)、9,12-十八碳二烯酸、9,12,15-十八碳三烯酸、7-羥基卡達(dá)烯、A-杜松醇、1-乙?；?4,6,8-三甲基甘菊環(huán)、鄰苯二甲酸二異辛酯、A-羥基豆蔻酸乙酯、棕櫚酸甲酯、Copaene、alpha-Calaco rene 等, 其中棕櫚酸、9,12-十八碳二烯酸、9,12,15-十八碳三烯酸、7-羥基卡達(dá)烯、1-乙?；?4,6,8-三甲基甘菊環(huán)含量較高；陜西產(chǎn)山茱萸揮發(fā)油成分有鄰苯二甲酸二異丁酯、鄰苯二甲酸單2-乙基己酯、7-羥基卡達(dá)烯、順-13-二十二烯酸酰胺、3,5-二叔丁基, 4-羥基苯甲醛、A-杜松醇、月桂酸、環(huán)己酮、1,14-十八碳二烯酸甲酯, 其中鄰苯二甲酸二異丁酯、鄰苯二甲酸單2-乙基己酯、7-羥基卡達(dá)烯、順-13-二十二烯酸酰胺含量較高。

表5 3產(chǎn)地山茱萸果肉中揮發(fā)油的化學(xué)成分及含量

　　3種不同來源的山茱萸果肉揮發(fā)油中僅僅有13 種共有成分, 其中8 種為各種烷烴, 含量所占比例也很大, 其他5 種共有成分: 1,2,4a, 5,6,8a-六氫-4,7,-二甲基-1-異丙基萘、a-杜松醇、1,4-二甲基-6-異丙基萘的相對含量均小于1.5；鄰苯二甲酸二異丁酯在陜西產(chǎn)山茱萸果肉揮發(fā)油中相對含量高達(dá)6.86,而在另兩個(gè)產(chǎn)地的相對含量都小于1；7-羥基卡達(dá)烯在三產(chǎn)地?fù)]發(fā)油中的相對含量分別為3.57、4.58、3.13此外, 鑒定出的山茱萸揮發(fā)油成分中還有酮、胺等化合物.通過實(shí)驗(yàn)可以看到, 不同產(chǎn)地的山茱萸中藥材所含揮發(fā)性成分存在一定差異, 可以進(jìn)一步推測不同產(chǎn)地藥材在臨床用藥上會(huì)產(chǎn)生不同的藥效, 這些研究為中藥材的進(jìn)一步應(yīng)用提供一定的理論依據(jù).

  不同產(chǎn)地山茱萸有機(jī)酸成分評(píng)測

　　山茱萸含有揮發(fā)性成份、糖苷類及苷元、鞣質(zhì)、有機(jī)酸類等四大類成份。其中有機(jī)酸類成份種類較多, 含量豐富, 如沒食子酸(gallicacid)、蘋果酸(malicacid)、酒石酸(tartaricacid)、熊果酸(ursolicacid)、齊墩果酸(oleanolicacid)、白樺脂酸(betulicacid)、月桂酸(lauricacid)等。目前發(fā)現(xiàn)不少有機(jī)酸有一定的生理活性, 據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道, 山茱萸醇提取物不僅對四氧嘧啶和腎上腺素性糖尿病大鼠有明顯的降血糖作用, 而且對鏈脲佐菌素(STZ)所形成的糖尿病大鼠也有類似作用,但對正常大鼠血糖無明顯影響, 并進(jìn)一步弄清其有效的主要成份為熊果酸。齊墩果酸鈉鹽通過口服給藥, 具有良好的降酶、保肝作用, 具有抵抗因CCL4引起的亞急性肝損傷的功效。

表6　不同產(chǎn)地的山茱萸總有機(jī)酸含量

　　有機(jī)酸類性質(zhì)活潑, 多數(shù)易溶于水, 容易發(fā)生化學(xué)變化導(dǎo)致含量降低。山茱萸藥材的總有機(jī)酸含量受多種因素的影響, 如產(chǎn)地、采收時(shí)間、加工方法、干燥方式等, 僅產(chǎn)地因素為客觀因素, 其余均受人為因素的影響。作者認(rèn)為有必要以有機(jī)酸含量為指標(biāo), 研究出一個(gè)最佳的采收、加工、干燥的方案。從表6看出:3、4號(hào)樣品總有機(jī)酸含量較高, 2號(hào)樣品含量最低。從外觀性狀看, 3、4號(hào)樣品顏色較鮮艷, 2號(hào)樣品顏色深暗。雖然以顏色的鮮艷成度來判斷有機(jī)酸含量的高低缺乏科學(xué)依據(jù),但以個(gè)大肉多、顏色鮮艷者為佳, 已成了人們判斷山茱萸藥材質(zhì)量優(yōu)劣的共識(shí)《中國藥典》2015年版從性狀、鑒別、雜質(zhì)檢查、熊果酸含量等幾個(gè)方面對山茱萸藥材質(zhì)量進(jìn)行了控制, 隨著有機(jī)酸的藥用價(jià)值被逐步開發(fā), 作者建議將總有機(jī)酸含量作為山茱萸質(zhì)量控制指標(biāo)之一。這樣有利于對山萸藥材質(zhì)量進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

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